QUẢNG CÁO
Vài Phút Quảng Cáo Sản Phẩm ![]()
Vài Phút Quảng Cáo Sản Phẩm
Mọi ý kiến đóng góp xin gửi vào Hòm thư: [email protected]
Kéo xuống để Tải ngay đề cương bản PDF đầy đủ: Sau “mục lục” và “bản preview”
(Nếu là đề cương nhiều công thức nên mọi người nên tải về để xem tránh mất công thức)
Bài Viết Liên Quan: : Khoá luận tốt nghiệp: Phân tích các nhân tố ảnh hưởng tới niềm tin của người tiêu dùng vào sản phẩm cà phê nguyên chất tại thành phố Thủ Đức
Tải ngay đề cương bản PDF tại đây:Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng kháng bệnh héo rũ gốc mốc trắng của cây lạc (Arachis hypogaea L.) được chuyển gen Chi42
ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ———— PHÙNG THỊ BÍCH HÒA NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH HÉO RŨ GỐC MỐC TRẮNG CỦA CÂY LẠC (Arachis hypogaea L.) ĐƯỢC CHUYỂN GEN Chi42 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HUẾ, 2023 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ————- PHÙNG THỊ BÍCH HÒA NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH HÉO RŨ GỐC MỐC TRẮNG CỦA CÂY LẠC (Arachis hypogaea L.) ĐƯỢC CHUYỂN GEN Chi42 Ngành: SINH LÝ HỌC THỰC VẬT Mã số: 9420112 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. NGUYỄN HOÀNG LỘC 2. TS. NGUYỄN XUÂN HUY HUẾ, 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Nguyễn Hoàng Lộc và TS. Nguyễn Xuân Huy. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực. Một phần kết quả của luận án đã được công bố trên các tạp chí và hội nghị khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả, phần còn lại chưa công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Những trích dẫn về bảng, hình, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác, tài liệu sử dụng trong luận án đều ghi rõ nguồn gốc và trích dẫn theo đúng quy định. Thừa Thiên Huế, ngày 06 tháng 03 năm 2023 Tác giả Phùng Thị Bích Hòa i LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án này, em xin bày tỏ lòng biết ơn đối với tất cả những cá nhân và tổ chức có liên quan, những người trực tiếp hoặc gián tiếp giúp đỡ em trong suốt ba năm qua. “Bạn không thể thành danh nếu không có sự giúp đỡ của giáo viên”. Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành của em dành cho hai Thầy giáo là GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc và TS. Nguyễn Xuân Huy, các thầy đã tận tình chỉ bảo và nhẫn nại với em trong suốt ba năm qua, đã giúp em hoàn thành luận án này và thực sự đã đưa em vào thế giới khoa học. Hai thầy đã hướng dẫn em hoàn thành và bố trí các thí nghiệm, dẫn dắt trong từng nội dung của luận án, hoàn thành các đề xuất nghiên cứu và tất cả các chương của luận án này. Tiếp theo, em muốn gửi lời cảm ơn đặc biệt đến Thầy giáo TS. Nguyễn Quang Đức Tiến, người Thầy, người Anh tuyệt vời, đã hướng dẫn em trong những ngày đầu tiến hành các thí nghiệm của luận án, các thí nghiệm về in vitro cây lạc và biểu hiện tạm thời gen chitinase ở cây thuốc lá. Người luôn dành cho em những lời động viên chân thành và đầy cởi mở. Em cũng dành lời cảm ơn đến Thầy giáo TS. Nguyễn Ngọc Lương, Thầy đã hướng dẫn, thiết kế thí nghiệm tạo kháng thể đa dòng trên chuột và tạo điều kiện chia sẻ một số hóa chất, thiết bị nghiên cứu. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô giáo TS. Lê Thị Hà Thanh, người bạn, người đồng nghiệp rất chân thành, đã tạo điều kiện và ủng hộ về tinh thần cho em rất nhiều trong quá trình hoàn thiện luận án. Em muốn gửi lời cảm ơn đến Thầy giáo TS. Nguyễn Minh Trí, Thầy đã giúp đỡ em rất nhiều trong các buổi bảo vệ chuyên đề và các thủ tục hồ sơ giấy tờ để em có thể bảo vệ thành công luận án. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến anh Nguyễn Tấn Vũ, anh đã tạo mọi điều kiện về hóa chất và thiết bị thí nghiệm trong suốt ba năm qua để em có thể hoàn thành luận án này. Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám đốc, Ban Đào tạo và Công tác Sinh viên Đại học Huế, Ban Lãnh đạo Khoa Sinh học và phòng Đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Khoa học; Ban Giám hiệu; Ban Lãnh đạo Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế đã có nhiều giúp đỡ quý báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận án. ii Tôi cũng muốn gửi lời cảm ơn đến Kỹ sư Nguyễn Hoàng Tuệ, người em đã đồng hành và giúp đỡ tôi rất nhiều trong toàn bộ thời gian thực hiện luận án và các thí nghiệm của luận án. Tôi cũng gửi lời cảm ơn đến các em sinh viên ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện các thí nghiệm của luận án, đã đồng hành cùng tôi suốt thời gian làm luận án (Nguyễn Thị Hằng (K38), Đặng Văn Thành, Hoàng Anh Thi, Trần Gia Cát Tường, Phạm Thị Huyền Trang (K39), Huỳnh Thị Quỳnh Trang, Hoàng Anh Thư, Nguyễn Ngọc Huyền Nhung, Nguyễn Thanh Nhàn, Lục Hoàng Linh, Huỳnh Thị Thu Hà, Hồ Thị Len (K40), Ths. Trần Quý Đức (K36), Huỳnh Kim Vũ, Nguyễn Thị Thanh Tuyên, Hoàng Lan Phương, Nguyễn Thị Trang, (K41)) và các em sinh viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế Khóa 2017 – 2021. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF) đã hỗ trợ một phần kinh phí cho em thực hiện luận án này. Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến quý thầy cô giáo, các anh chị em đồng nghiệp, các anh chị em học viên, sinh viên đã động viên, quan tâm và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận án. Xin gửi đến bố và mẹ yêu quý của con những lời biết ơn chân thành nhất. Bố mẹ luôn ở bên cạnh con để chia sẻ những thành công của con. Cuối cùng nhưng không kém phần quan trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến người chồng yêu quý và hai con đã luôn bên cạnh động viên, khuyến khích, là niềm tự hào của tôi. Một lần nữa xin cảm ơn về tất cả. Phùng Thị Bích Hòa iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN………………………………………………………………………………………………………….. i LỜI CẢM ƠN ………………………………………………………………………………………………………………. ii MỤC LỤC …………………………………………………………………………………………………………………… iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ………………………………………………… vii KÝ HIỆU VIẾT TẮT CÁC VECTOR MANG GEN CHITINASE…………………………… x DANH MỤC HÌNH …………………………………………………………………………………………………….. xi DANH MỤC BẢNG ………………………………………………………………………………………………….. xiv MỞ ĐẦU ………………………………………………………………………………………………………………………. 1 1. Lý do chọn đề tài ……………………………………………………………………………………………………. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ………………………………………………………………………………………………. 2 3. Nội dung nghiên cứu………………………………………………………………………………………………. 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn …………………………………………………………………………………. 3 5. Những đóng góp mới của luận án ……………………………………………………………………………. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU …………………………………….. 4 1.1. Bệnh héo rũ gốc mốc trắng do nấm Sclerotium rolfsii gây ra và biện pháp phòng trừ …………………………………………………………………………………………………………………………….. 4 1.1.1. Cây lạc ……………………………………………………………………………………………………. 4 1.1.2. Các bệnh hại do nấm gây ra ở cây lạc …………………………………………………………. 5 1.1.3. Bệnh héo rũ gốc mốc trắng do nấm S. rolfsii ……………………………………………….. 5 1.1.4. Cơ chế kháng nấm bệnh của cây lạc………………………………………………………….. 10 1.1.5. Tình hình nghiên cứu các biện pháp phòng trừ bệnh do S. rolfsii gây ra ở cây lạc trên thế giới và Việt Nam …………………………………………………………………………………. 12 1.2. Enzyme chitinase ………………………………………………………………………………………………. 16 1.2.1. Sự phân bố chitinase trong tự nhiên ………………………………………………………….. 16 1.2.2. Phân loại chitinase ………………………………………………………………………………….. 17 1.2.3. Cơ chế phản ứng của chitinase …………………………………………………………………. 18 1.2.4. Tình hình nghiên cứu chitinase từ Trichoderma …………………………………………. 19 1.3. Cải thiện khả năng kháng nấm của cây lạc bằng kỹ thuật chuyển gen …………………… 23 1.3.1. Hệ thống vector trong biến nạp gen thông qua A. tumefaciens ……………………… 23 1.3.2. Các promoter sử dụng trong chuyển gen thực vật ……………………………………….. 24 1.3.3. Tình hình nghiên cứu về promoter đặc hiệu rễ……………………………………………. 25 1.3.4. Thay đổi mã di truyền của gen đích cho phù hợp với hệ thống biểu hiện ………. 27 1.4. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tăng cường khả năng kháng nấm ở cây lạc ….. 27 1.4.1. Hệ thống tái sinh và quy trình chuyển gen ở cây lạc……………………………………. 27 iv 1.4.2. Tình hình nghiên cứu chuyển gen chitinase vào cây lạc nhằm nâng cao khả năng kháng nấm………………………………………………………………………………………………………. 29 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………………….. 31 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu……………………………………………………………………………………… 31 2.1.1. Nguyên liệu thực vật……………………………………………………………………………….. 31 2.1.2. Các vector, chủng vi khuẩn và vi nấm ………………………………………………………. 32 2.2. Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………………………………………………. 33 2.2.1. Hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro giống lạc L14 ……………………………………. 35 2.2.2. Tối ưu hóa trình tự gen Chi42 ………………………………………………………………….. 35 2.2.3. Sản xuất kháng thể đa dòng kháng chitinase 42 kDa …………………………………… 36 2.2.4. Xác định hoạt tính và đặc điểm của Ta-CHI42 …………………………………………… 38 2.2.5. Tạo dòng gen chitinase và promoter Asy trong vector biểu hiện thực vật………. 39 2.2.6. Tam hợp ………………………………………………………………………………………………… 39 2.2.7. Chuyển gen chitinase bằng kỹ thuật thấm nhập ………………………………………….. 41 2.2.8. Biến nạp gen chitinase thông qua Agrobacterium……………………………………….. 41 2.2.9. Nhận dạng và phân tích biểu hiện của gen chuyển ……………………………………… 42 2.2.10. Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của chitinase thực vật ……………………………. 43 2.2.11. Đặc điểm sinh lý và hóa sinh của cây lạc chuyển gen in vivo ……………………… 44 2.2.12. Xử lý thống kê ……………………………………………………………………………………… 47 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ………………………………………………………………………. 47 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN……………………………………. 48 3.1. Hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro ở cây lạc ……………………………………………………… 48 3.1.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng đến khả năng nảy mầm in vitro của hạt….. 48 3.1.2. Ảnh hưởng của phương thức nảy mầm ……………………………………………………… 49 3.1.3. Khả năng tái sinh chồi từ các bộ phận khác nhau của cây lạc in vitro ……………. 50 3.1.4. Ảnh hưởng của BAP lên tái sinh chồi in vitro từ trụ trên lá mầm …………………. 51 3.1.5. Ảnh hưởng của BAP lên tái sinh chồi in vitro từ lá mầm …………………………….. 52 3.1.6. Ảnh hưởng của NAA và IBA lên khả năng tạo rễ của chồi in vitro ………………. 53 3.2. Sản xuất kháng thể đa dòng kháng chitinase ở chuột ……………………………………………. 54 3.2.1. Tổng hợp các gen chitinase ……………………………………………………………………… 54 3.2.2. Tạo dòng các gen chitinase trong vector biểu hiện E. coli pQE30 ………………… 55 3.2.3. Biểu hiện các gen chitinase trong E. coli …………………………………………………… 55 3.2.4. Sản xuất kháng thể đa dòng kháng Ta-CHI42 ……………………………………………. 56 3.2.5. Hoạt tính thủy phân chitin của Ta-CHI42 ………………………………………………….. 58 3.2.6. Đặc điểm của enzyme Ta-CHI42 ……………………………………………………………… 59 3.2.7. Hoạt tính kháng nấm in vitro của Ta-CHI42 ………………………………………………. 62 3.3. Thiết kế các cấu trúc biểu hiện chitinase ở thực vật ……………………………………………… 63 v 3.3.1. Tạo dòng gen chitinase vào vector pMYV719 ……………………………………………. 63 3.3.2. Tạo dòng gen chitinase và promoter Asy vào vector pMYV719 …………………… 66 3.3.3. Tạo vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 mang gen chitinase ………………………… 68 3.4.1. Biểu hiện của các gen chitinase ………………………………………………………………… 69 3.4.2. Hoạt tính thủy phân chitin của Ta-CHI42 ………………………………………………….. 70 3.4.3. Hoạt tính kháng nấm của enzyme Ta-CHI42 trong điều kiện in vitro ……………. 74 3.5. Ảnh hưởng của một số yếu tố lên hiệu quả chuyển gen chitinase vào cây lạc qua trung gian A. tumefaciens ………………………………………………………………………………………………….. 77 3.5.1. Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy ……………………………………………………… 77 3.5.2. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn ………………………………………………………………. 77 3.5.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm ………………………………………………………….. 78 3.5.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy ……………………………………………………. 78 3.5.5. Ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone ……………………………………………………. 79 3.5.6. Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin ………………………………………………………….. 79 3.5.7. Ảnh hưởng của nồng độ cefotaxime………………………………………………………….. 80 3.6. Biến nạp gen chitinase vào cây lạc thông qua A. tumefaciens ……………………………….. 81 3.6.1. Chuyển gen chitinase vào cây lạc ……………………………………………………………… 81 3.6.2. Sàng lọc các cây lạc chuyển gen bằng PCR ……………………………………………….. 84 3.6.3. Biểu hiện các gen chitinase trong cây lạc…………………………………………………… 86 3.6.4. Hoạt tính thủy phân chitin của chitinase ……………………………………………………. 88 3.6.5. Hoạt tính kháng nấm của các dòng lạc chuyển gen …………………………………….. 91 3.7. Đặc điểm sinh lý và hóa sinh của cây lạc chuyển gen sinh trưởng in vivo ……………… 94 3.7.1. Chọn giá thể thích hợp…………………………………………………………………………….. 94 3.7.2. Đặc điểm sinh lý …………………………………………………………………………………….. 98 3.7.3. Đặc điểm hóa sinh ………………………………………………………………………………… 109 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………………………………………………………………….. 113 1. Kết luận ……………………………………………………………………………………………………………… 113 2. Kiến nghị …………………………………………………………………………………………………………… 114 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN…………………….. 115 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………………………………………… 117 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Amp : Ampicillin ANOVA : Analysis of variance APS : Ammonium persulfate AS : Acetosyringone Asp : Aspartic acid BA : N6-Benzyl adenin BAP : Benzylaminopurine BCIP : 5-bromo, 4-chloro, 3-indolyl phosphate bp : Base pair CA : Cetrimide agar cal : Calories Cf : Cefotaxime Chl : Chlorophyll COOL : Codon Optimization OnLine CRAG : Centre for Research in Agricultural Genomics cs : Cộng sự CTAB : Cetyltrimethylammonium bromide DMSO : Dimethylsulfoxide DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxynucleoside triphosphate DNS : 3,5-Dinitrosalicylic acid dp35S : Duplicated 35S promoter ĐHST : Điều hòa sinh trưởng EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid F : Forward primer Glu : Glutamic acid ha : Hecta HgCl2 : Thủy ngân (II) chloride IAA : 3-Indoleacetic acid vii IBA : Indole-3-butyric acid IPTG : Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside 2-iP : 2-Isopentenyladenine ISSR : Inter-Simple Sequence Repeats – (Chuỗi lặp lại đơn giản bên trong) Km : Kanamycin kb : Kilobase pair kDa : Kilo Daltons KIN : Kinetin KTST : Kích thích sinh trưởng MES : 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid mRNA : Messenger ribonucleic acid (RNA thông tin) MS : Murashige và Skoog MW : Khối lượng phân tử NAA : α-Naphthaleneacetic acid NaOCl : Sodium hypochlorite NBT : Nitro-blue tetrazolium NC : Negative control (đối chứng âm tính) Nxb : Nhà xuất bản OD : Optical density (mật độ quang) PBS : Phosphate-buffered saline PC : Positive control (đối chứng dương tính) PCA : Potato glucose carot PDA : Potato dextrose agar PDB : Potato dextrose broth PCR : Polymerase chain reaction PGA : Potato-glucose-agar Phe : Phenylalanine pNP-β-GlcNAc : 4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide R : Reverse primer RNA : Ribonucleic acid RT- qPCR : Reverse transcription – Quantitative PCR SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulphate – polyacrylamide gel electrophoresis viii T0 : Thế hệ cây chuyển gen đầu tiên TBS : Tris buffered saline TBST : Tris-buffered saline with Tween 20 (Đệm Tris có Tween 20) TDZ : Thidiazuron TEMED : Tetramethylethylenediamine TGST : Thời gian sinh trưởng TMN : Tris-MgCl2-NaCl buffer TNHH MTV : Trách nhiệm hữu hạn một thành viên tRNA : Transfer RNA Trp : Tryptophan Tyr : Tyrosine U : Unit UV : Ultraviolet w/v : Weight/Volume YEP : Yeast extract peptone (cao chiết nấm men) ix KÝ HIỆU VIẾT TẮT CÁC VECTOR MANG GEN CHITINASE Tên vector Vector mang gen chitinase Promoter pNHL19.1 pMYV719/Chi42 Biểu hiện thường pNHL19 pNHL19.2 pMYV719/syncodChi42-1 trực (dp35S) pNHL19.3 pMYV719/syncodChi42-2 pNHL20.1 pMYV719/Asy/Chi42 Biểu hiện đặc hiệu pNHL20 pNHL20.2 pMYV719/Asy/syncodChi42-1 rễ (pAsy) pNHL20.3 pMYV719/Asy/syncodChi42-2 x DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc đại diện của 4 loại nấm bệnh hại lạc …………………………………………………… 6 Hình 1.2. Triệu chứng bệnh hại trên cây lạc do S. rolfsii gây ra………………………………………… 7 Hình 1.3. Chu kỳ bệnh héo rũ gốc mốc trắng trên lạc do S. rolfsii gây ra ………………………….. 8 Hình 1.4. Nuôi cấy S. rolfsii trên thạch dextrose khoai tây ……………………………………………….. 9 Hình 1.5. Sự phát triển sợi nấm S. rolfsii trên gốc (A) và vỏ quả (B) cây lạc …………………… 10 Hình 1.6. Cấu trúc chitin và các kiểu phân cắt của các loại chitinase ………………………………. 18 Hình 2.1. Quả và hạt của giống lạc L14…………………………………………………………………………. 31 Hình 2.2. Cây N. benthamiana………………………………………………………………………………………. 31 Hình 2.3. Vector pMYV719 …………………………………………………………………………………………. 32 Hình 2.4. Vector pMYV508 …………………………………………………………………………………………. 32 Hình 2.5. Vector pQE30 ……………………………………………………………………………………………….. 33 Hình 2.6. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát…………………………………………………………………………….. 34 Hình 3.1. Hạt lạc sau 10 ngày gieo theo các phương thức khác nhau………………………………. 49 Hình 3.2. Nuôi cấy in vitro cây lạc ………………………………………………………………………………… 51 Hình 3.3. Tái sinh chồi từ trụ trên lá mầm (A), trụ dưới lá mầm (B) và mắt lá mầm (C) của cây lạc in vitro sau 4 tuần nuôi cấy ………………………………………………………………………………… 52 Hình 3.4. Cắt hạn chế vector pQE30 tái tổ hợp mang các gen chitinase 42 kDa bằng BamHI và SacI …………………………………………………………………………………………………………………………. 55 Hình 3.5. SDS-PAGE của protein hòa tan tổng số từ tế bào E. coli M15 được biến nạp vector pQE30 mang các gen syncodChi42-1 (a), syncodChi42-2 (b) và Chi42 (c) ………….. 57 Hình 3.6. SDS-PAGE (a) và Western blot (b) của enzyme Ta-CHI42.. ………………………….. 58 Hình 3.7. Hoạt tính thủy phân chitin của enzyme Ta-CHI42 tinh sạch ……………………………. 59 Hình 3.8. Đặc điểm của enzyme Ta-CHI42 tinh sạch …………………………………………………….. 60 Hình 3.9. Ảnh hưởng của enzyme Ta-CHI42 tinh sạch lên sinh trưởng của A. niger ………. 62 Hình 3.10. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện thực vật nhóm pNHL19………………………………… 64 Hình 3.11. Khuếch đại PCR các gen chitinase 42 kDa từ khuẩn lạc E. coli với các cặp mồi đặc hiệu………………………………………………………………………………………………………………………… 64 Hình 3.12. Cắt hạn chế vector pNHL19.1 bằng XbaI và SacI …………………………………………. 65 Hình 3.13. Cắt hạn chế vector pNHL19.2 bằng XbaI và SacI …………………………………………. 65 Hình 3.14. Cắt hạn chế vector pNHL19.3 bằng XbaI và SacI …………………………………………. 65 Hình 3.15. Sơ đồ thiết kế nhóm vector biểu hiện thực vật pNHL20………………………………… 66 Hình 3.16. Khuếch đại PCR các gen chitinase từ khuẩn lạc E. coli với các cặp mồi đặc hiệu67 Hình 3.17. Cắt hạn chế các vector pNHL20 bằng XbaI và SacI. …………………………………….. 67 Hình 3.18. Khuếch đại PCR các gen chitinase ở nhóm vector pNHL19 từ A. tumefaciens LBA4404……………………………………………………………………………………………………………………… 68 xi Hình 3.19. Khuếch đại PCR các gen chitinase ở nhóm vector pNHL20 từ A. tumefaciens LBA4404……………………………………………………………………………………………………………………… 69 Hình 3.20. Cắt hạn chế các vector pNHL19 (trái) và vector pNHL20 (phải) bằng XbaI và SacI ……………………………………………………………………………………………………………………………… 69 Hình 3.21. Điện di SDS-PAGE dịch chiết protein từ lá cây N. benthamiana chuyển gen .. 71 Hình 3.22. Phân tích Western blot dịch chiết protein từ lá cây N. benthamiana chuyển gen72 Hình 3.23. Cường độ của tín hiệu Western blot. PC: enzyme Ta-CHI42 tinh sạch từ vi khuẩn làm đối chứng dương………………………………………………………………………………………….. 73 Hình 3.24. Hoạt tính thủy phân colloidal chitin của enzyme Ta-CHI42 từ lá của cây N. benthamiana chuyển gen ………………………………………………………………………………………………. 73 Hình 3.25. Hoạt tính chitinase của enzyme Ta-CHI42 từ cây N. benthamiana chuyển gen chitinase sau 3-7 ngày xâm nhiễm…………………………………………………………………………………. 74 Hình 3.26. Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm S. rolfsii của enzyme Ta-CHI42 từ cây N. benthamiana mang gen syncodChi42-1 và syncodChi42-2…………………………………………….. 75 Hình 3.27. Ảnh hưởng của các yếu tố đến tỷ lệ lá mầm có phôi tạo chồi và sống sót ở giống lạc L14 qua biến nạp trung gian A. tumefaciens……………………………………………………………… 78 Hình 3.28. Ảnh hưởng của nồng độ cefotaxime (mg/L) đến tỷ lệ mẫu tạo chồi, sống sót và sạch khuẩn của cây lạc chuyển gen ……………………………………………………………………………….. 80 Hình 3.29. Cây lạc L14 biến nạp vector pNHL19.2 …………………………………………………. 83 Hình 3.30. Cây lạc L14 biến nạp vector pNHL20.3 ……………………………………………………….. 83 Hình 3.31. Cây lạc L14 biến nạp vector pNHL20.2 vào mắt lá mầm ……………………………… 84 Hình 3.32. Khuếch đại PCR đoạn chỉ thị của các gen mã hóa chitinase 42 kDa ở cây lạc chuyển gen dùng vector pNHL19………………………………………………………………………………….. 85 Hình 3.33. Khuếch đại PCR đoạn chỉ thị của các gen mã hóa chitinase kDa ở cây lạc chuyển gen dùng vector pNHL20………………………………………………………………………………….. 86 Hình 3.34. Phân tích biểu hiện của Ta-CHI42 ở các cây lạc chuyển gen dùng vector pNHL19……………………………………………………………………………………………………………………….. 87 Hình 3.35. Phân tích biểu hiện của Ta-CHI42 ở các cây lạc chuyển gen dùng vector pNHL20……………………………………………………………………………………………………………………….. 88 Hình 3.36. Hoạt tính thủy phân colloidal chitin của enzyme Ta-CHI42 từ dịch chiết protein của rễ cây lạc chuyển gen dùng vector pNHL19 ……………………………………………………………. 89 Hình 3.37. Hoạt tính thủy phân colloidal chitin của enzyme Ta-CHI42 từ dịch chiết protein của rễ cây lạc chuyển gen dùng vector pNHL20 ……………………………………………………………. 89 Hình 3.38. Hoạt tính chitinase của các dòng lạc chuyển gen dùng vector pNHL20 …………. 90 Hình 3.39. Hoạt tính chitinase của các dòng lạc chuyển gen dùng vector pNHL19 …………. 90 Hình 3.40. Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm in vitro đối với S. rolfsii của rễ cây lạc chuyển gen dùng vector pNHL19 ……………………………………………………………………………………………… 92 xii Hình 3.41. Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm in vitro đối với S. rolfsii của rễ cây lạc chuyển gen dùng vector pNHL20 ……………………………………………………………………………………………… 92 Hình 3.42. Khả năng kháng S. rolfsii của các dòng lạc chuyển gen chitinase trong điều kiện in vivo…………………………………………………………………………………………………………………………… 93 Hình 3.44. Cây lạc chuyển gen chitinase trồng trong nhà lưới ………………………………………. 112 xiii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của các mồi đặc hiệu của các gen chitinase ……………… 40 Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của các mồi đặc hiệu cho đoạn chỉ thị của các gen chitinase …………………………………………………………………………………………………………. 42 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng đến khả năng nảy mầm của hạt lạc. …. 48 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của phương thức nảy mầm hạt lạc. …………………………………….. 49 Bảng 3.3. Tái sinh chồi từ các loại mẫu nuôi cấy khác nhau trên môi trường MS bổ sung BAP 4 mg/L và NAA 0,1 mg/L …………………………………………………………………. 50 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP lên tái sinh chồi của trụ trên lá mầm. ……………………. 52 Bảng 3.5. Tái sinh chồi từ lá mầm trên môi trường MS chứa 4 mg/L BAP. ……………. 53 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của NAA và IBA đến khả năng tạo rễ của chồi in vitro ………… 54 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của enzyme Ta-CHI42 tinh sạch lên sinh khối tươi và khô của sợi nấm A. niger sau 48 giờ nuôi cấy …………………………………………………………………. 62 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của enzyme Ta-CHI42 từ cây N. benthamiana mang gen syncodChi42-1 và syncodChi42-2 lên sinh khối tươi và khô của sợi nấm S. rolfsii sau 36 giờ nuôi cấy ……………………………………………………………………………………………….. 75 Bảng 3.9. Hiệu quả chuyển gen chitinase vào các loại mẫu khác nhau ở cây lạc ……… 82 Bảng 3.10. Khả năng kháng S. rolfsii của các dòng lạc chuyển gen chitinase trồng trong điều kiện in vivo ……………………………………………………………………………………… 94 Bảng 3.12. Thời gian sinh trưởng và phát triển của các dòng lạc chuyển gen chitinase. ………………………………………………………………………………………………………… 98 Bảng 3.13. Chiều cao thân chính của các dòng lạc chuyển gen ở các giai đoạn sinh trưởng và phát triển. ………………………………………………………………………………………. 100 Bảng 3.14. Số cành cấp 1 và tổng số cành trên cây của các dòng lạc chuyển gen chitinase ……………………………………………………………………………………………………….. 101 Bảng 3.15. Số lá trên cây của các dòng lạc chuyển gen chitinase…………………………. 103 Bảng 3.17. Hàm lượng chlorophyll của các dòng lạc chuyển gen chitinase …………… 106 Bảng 3.18. Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng lạc chuyển gen chitinase….. 107 Bảng 3.19. Thành phần hóa sinh trong hạt lạc khô của các dòng lạc chuyển gen chitinase ……………………………………………………………………………………………………….. 111 xiv MỞ ĐẦU 1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Lạc (Arachis hypogaea L.) là loài cây họ đậu quan trọng được trồng rộng rãi ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới để làm thực phẩm và lấy dầu [133]. Ở Việt Nam, lạc là một trong những cây lấy dầu quan trọng nhất, với tổng diện tích 160 nghìn ha, năng suất 2,5 tấn/ha và sản lượng 400 nghìn tấn vào năm 2021 [276]. Tuy nhiên, cây lạc dễ nhiễm các loại nấm bệnh, đặc biệt là nấm sinh ra trong đất, dẫn đến năng suất thấp và chất lượng hạt giống kém. Trong những năm gần đây, bệnh thối rễ và thối thân do Sclerotium rolfsii gây ra đã trở thành mối đe dọa lớn đối với sản xuất lạc, đây là bệnh truyền qua đất có sức tàn phá trên thế giới. S. rolfsii chủ yếu gây hại phần gốc thân của cây lạc và làm cho toàn bộ cây bị héo, chết và làm giảm sản lượng lạc từ 10-80% [64], [292]. Một số biện pháp phòng trừ được nghiên cứu áp dụng hiện nay như thuốc hóa học [210], sử dụng các vi sinh vật đối kháng [77], [222], luân canh cây trồng [14]. Trong đó, tạo giống cây trồng mang các gen kháng bệnh được coi là phương thức hiệu quả và kinh tế nhất để kiểm soát bệnh và thân thiện với môi trường. Chitinase (EC 3.2.1.14) là một họ các enzyme xúc tác quá trình thủy phân các liên kết β-1,4 N-acetyl-β-D-glucosamine của chitin. Chitin là một trong những polysaccharide phổ biến trong tự nhiên [61] và là thành phần chính của khung cấu trúc thành tế bào nấm [150], bộ xương ngoài và niêm mạc ruột của côn trùng và vỏ của các loài giáp xác [260]. Chitinase rất đa dạng về cấu trúc và cơ chế hoạt động, được ứng dụng phổ biến trong kiểm soát sâu bệnh hại cây trồng [205], tổng hợp chitooligosaccharide [294], công nghiệp thực phẩm và dược phẩm, xử lý chất thải chế biến thủy sản và sản xuất nhiên liệu sinh học [222]. Trong sản xuất nông nghiệp, chitinase là một trong những tác nhân sinh học kháng nấm bệnh ở cây trồng hiệu quả nhất [146]. Nhiều loài nấm Trichoderma có khả năng tiết chitinase ngoại bào nên chúng thường được sử dụng để kiểm soát các bệnh nấm hại cây trồng [46], [193]. Đến nay, một số gen chitinase của các chủng Trichoderma đã được tạo dòng và biểu hiện dị chủng trong một số vật chủ như Chit46 từ T. harzianum trong Pichia pastoris [86], Chit33 và Chit42 từ T. harzianum trong E. coli [52], ech42 từ T. aureoviride trong Saccharomyces cerevisiae [134]. Và một số gen mã hóa chitinase từ các sinh vật khác, như chitinase-3 và Rchit từ lúa [124], [213] hoặc chitinase từ thuốc lá [228] đã được 1 đưa vào cây lạc để ngăn ngừa nhiễm nấm. Tuy nhiên, chưa nghiên cứu nào biến nạp gen chitinase từ vi sinh vật vào cây lạc, đặc biệt là các loài thuộc chi Trichoderma. Nghiên cứu chuyển gen chitinase của Trichoderma vào cây lạc để tăng tính kháng nấm là một giải pháp hiệu quả, thân thiện với môi trường và hiện đang được quan tâm ứng dụng trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau. Trong đó, gen mã hóa chitinase 42 kDa của T. asperellum thuộc endochitinase là nhóm enzyme được quan tâm và nghiên cứu chi tiết hơn cả vì tính đa dạng, sự hiện diện thường xuyên khi nuôi cảm ứng với cơ chất chứa chitin và khả năng ứng dụng trong kiểm soát sinh học của nó hơn hẳn các nhóm còn lại trong hệ enzyme thủy phân chitin [116], [159]. Nghiên cứu của Loc và cs (2013) cho thấy gen Chi42 mã hóa chitinase 42 kDa của T. asperellum có hoạt tính mạnh [157] nhưng chưa có công trình nào thực hiện chuyển gen này vào cây lạc để tạo ra dòng lạc có khả năng kháng nấm cao. Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng kháng bệnh héo rũ gốc mốc trắng của cây lạc (Arachis hypogaea L.) được chuyển gen Chi42”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Biểu hiện thành công gen mã hóa chitinase 42 kDa từ T. asperellum SH16 ở giống lạc L14 và tạo được các dòng lạc chuyển gen có khả năng kháng nấm S. rolfsii mạnh. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU (1) Hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro giống lạc L14 (2) Sản xuất kháng thể đa dòng kháng chitinase 42 kDa ở chuột để phục vụ phân tích Western blot (3) Thiết kế vector biểu hiện ở thực vật mang các gen chitinase 42 kDa (4) Biểu hiện tạm thời các gen chitinase 42 kDa trong cây Nicotiana benthamiana (5) Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên hiệu quả chuyển gen chitinase 42 kDa vào cây lạc qua trung gian A. tumefaciens (6) Nghiên cứu biến nạp các gen chitinase 42 kDa vào cây lạc thông qua A. tumefaciens (7) Nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý và hóa sinh của các dòng lạc chuyển gen chitinase 42 kDa sinh trưởng trong điều kiện in vivo 2 4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 4.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới, có tính hệ thống về tối ưu hóa gen chitinase 42 kDa để biểu hiện ở thực vật, vector chuyển gen, chuyển gen chitinase 42 kDa của T. asperellum vào cây lạc để tăng khả năng kháng bệnh héo rũ gốc mốc trắng do nấm S. rolfsii gây ra, đồng thời tạo ra các dòng lạc chuyển gen có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả luận án cũng là cơ sở để ứng dụng biện pháp cải thiện khả năng kháng nấm của cây lạc nhằm nâng cao năng suất và hiệu quả sản xuất lạc, góp phần bảo vệ môi trường. Đồng thời, kết quả nghiên cứu của luận án được đăng tải trên các tạp chí khoa học chuyên ngành trong nước và quốc tế là tài liệu tham khảo có giá trị trong giảng dạy và nghiên cứu. 5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN – Đã hoàn thiện quy trình tái sinh in vitro cho giống lạc L14: khử trùng hạt lạc bằng NaOCl 65% trong 10 phút, tái sinh các loại mẫu cấy khác nhau của cây lạc và tạo cụm chồi trên môi trường MS có bổ sung 4 mg/L BAP và 0,1 mg/L NAA, tạo rễ trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L NAA. – Đã tối ưu hóa trình tự nucleotide gen Chi42 hoang dại mã hóa chitinase 42 kDa của T. asperellum SH16 cho biểu hiện thực vật. Hai trình tự có bộ ba tối ưu cho biểu hiện ở thực vật đã được đăng ký trên GenBank với các mã số MT083802.1 (syncodChi42-1) và MT083803.1 (syncodChi42-2). Đã thiết kế thành công các vector biểu hiện thực vật mang lần lượt 3 gen chitinase (Chi42, syncodChi42-1 và syncodChi42-2) dưới sự điều khiển biểu hiện của một trong hai loại promoter đặc hiệu rễ pAsy hoặc promoter thường trực dp35S. – Đã biểu hiện và tinh sạch thành công chitinase 42 kDa ở E. coli. Đồng thời đã sử dụng enzyme này để sản xuất thành công kháng thể đa dòng kháng chitinase 42 kDa ở chuột phục vụ cho phân tích Western blot. – Đã tiếp hợp thành công các vector biểu hiện thực vật mang các gen chitinase 42 kDa vào A. tumefaciens LBA4404 và đã biểu hiện tạm thời các gen này ở dạng hoạt động mạnh trong cây N. benthamiana bằng kỹ thuật thấm nhập. – Đã biến nạp và tuyển chọn được 16 dòng lạc L14 mang các gen Chi42, syncodChi42-1 và syncodChi42-2 có mức độ biểu hiện chitinase cao. Sự hiện diện của các gen chitinase đã làm tăng hoạt tính kháng nấm S. rolfsii của các dòng lạc chuyển gen trong cả điều kiện in vitro và in vivo. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. BỆNH HÉO RŨ GỐC MỐC TRẮNG DO NẤM Sclerotium rolfsii GÂY RA VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ 1.1.1. Cây lạc Lạc (Arachis hypogaea L.) là một loại cây trồng có hiệu quả kinh tế cao và có giá trị đa dạng về các mặt dinh dưỡng, chăn nuôi, trồng trọt cũng như trong công nghiệp. Trong hạt lạc có đầy đủ các thành phần như: lipid (40-54%), protein (20-30%), carbohydrate (16-22%), vitamin (A, B, D, E và K), là nguồn bổ sung dinh dưỡng quan trọng cho con người [282]. Protein của hạt lạc có đủ 8 loại amino acid không thay thế. Lạc là loại thực phẩm cung cấp năng lượng cao, 100 g hạt lạc cung cấp 567 cal [189]. Hạt có thể sử dụng trực tiếp hoặc ép dầu thực vật, sữa lạc, bơ lạc, phomat lạc. Ngoài ra, khô dầu lạc, các sản phẩm phụ dầu lạc, cám lạc, thân, lá còn được sử dụng làm thức ăn trong chăn nuôi và làm phân bón cũng rất tốt. Trong công nghiệp, lạc phục vụ cho công nghiệp ép dầu, công nghiệp thực phẩm và trong nhiều ngành công nghiệp khác (chất dẻo, mực in…). Hạt lạc là mặt hàng có giá trị xuất khẩu cao. Cây lạc được trồng phổ biến ở hơn 100 nước với diện tích khoảng 22 triệu ha, là cây trồng quan trọng đối với các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở châu Á, châu Phi, Bắc và Nam Mỹ [243]. Châu Á và châu Mỹ là hai châu lục có khối lượng xuất khẩu lạc lớn nhất (chiếm 78,56% khối lượng lạc xuất khẩu trên thế giới). Năm 2020, sản lượng lạc thế giới ước tính đạt 47 triệu tấn, sản lượng lạc của Việt Nam đạt khoảng 434 ngàn tấn [275]. Sản lượng lạc xuất khẩu của Việt Nam giai đoạn 2019-2020 ước tính đạt khoảng 10 ngàn tấn [275]. Không chỉ mang lại hiệu quả kinh tế cao, trồng lạc còn có tác dụng cải tạo đất, chống xói mòn. Các vi khuẩn Rhizobium có khả năng cố định đạm sống cộng sinh trong nốt sần của cây lạc là đặc tính tuyệt vời làm lạc trở thành cây có khả năng bảo vệ, duy trì và cải thiện độ phì nhiêu của đất rất hiệu quả [18]. Theo ước tính, các cây họ Đậu nói chung có thể đưa lại 70 triệu tấn đạm mỗi năm từ nguồn nitrogen không khí [58]. Ở Thừa Thiên Huế, lạc cũng được xem là một trong những cây trồng quan trọng, có hiệu quả kinh tế cao. Trong những năm gần đây, ở một số vùng sản xuất nông 4 CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD LV.11: Bộ Luận Văn Tốt Nghiệp Chuyên Ngành Tài Chính Ngân Hàng 172 tài liệu 810 lượt tải Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng pdf 117 p | 294 | 80 Luận án Tiến sĩ Sinh học: Tạo dòng chịu hạn và phân lập gen Cystain liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (Arachis hypogaea L.) pdf 146 p | 191 | 59 Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (Penaeus Monodon) pdf 0 p | 213 | 36 Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số chỉ tiêu quang hợp và mối tương quan của chúng với năng suất cà phê vối tại Đăk Lăk pdf 127 p | 157 | 28 Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng pdf 24 p | 183 | 17 Luận án Tiến sĩ Sinh học: Khu hệ Thân mềm Chân bụng (Gastropoda) ở cạn tỉnh Sơn La pdf 222 p | 111 | 10 Luận án Tiến sĩ Sinh học: Cấu trúc quần xã Động vật phù du trong Vịnh Bình Cang – Nha Trang và sự vận chuyển Cacbon và Nitơ từ Thực vật phù du sang Động vật phù du pdf 174 p | 122 | 9 Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Tạo dòng chịu hạn và phân lập gen Cystain liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (Arachis hypogaea L.) pdf 0 p | 123 | 5 Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp Cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu Bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn pdf 218 p | 20 | 5 Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp tạo màng sinh học phân lập tại Việt Nam pdf 134 p | 22 | 5 Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng phân hủy một số thành phần hydrocarbon có trong nước thải nhiễm dầu của màng sinh học từ vi sinh vật được gắn trên vật liệu mang pdf 129 p | 15 | 4 Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu cơ sở khoa học phục vụ cho việc sinh sản nhân tạo cá nác [Boleophthalmus pectinirostris (Linnaeus, 1758)] pdf 165 p | 6 | 4 Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Ve giáp (Acari: Oribatida) ở hệ sinh thái đất cao nguyên Mộc Châu, tỉnh Sơn La pdf 27 p | 7 | 3 Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam pdf 174 p | 50 | 3 Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện gen GmDREB6 nhằm nâng cao khả năng chịu mặn ở cây chuyển gen pdf 142 p | 28 | 2 Luận án Tiến sĩ Sinh học: Ve giáp (Acari: Oribatida) ở hệ sinh thái đất cao nguyên Mộc Châu, tỉnh Sơn La pdf 219 p | 28 | 2 Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu lên men và thu nhận polyhydroxyalkanoates từ vi khuẩn phân lập ở một số vùng đất của Việt Nam pdf 159 p | 104 | 2 Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh pdf 193 p | 14 | 1 THÔNG
Quảng Cáo
 được chuyển gen Chi42...){kind=link}